RIG-I 配體

• 5’ppp-dsRNA

5’ppp-dsRNA 是一種5’三磷酸雙鏈RNA，通過(guò)一個(gè)由19個(gè)核酸分子通過(guò)磷酸二酯鍵聚合成的5`三磷酸單鏈RNA和其非三磷酸互補(bǔ)鏈雜交形成。5’ppp-dsRNA的序列可以通過(guò)篩選各種序列突變體確定。未加帽的5’三磷酸雙鏈RNA能夠被RIG-I特異性識(shí)別。

• 3p-hpRNA

3p-hpRNA是通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄甲型流感病毒（H1N1）序列而產(chǎn)生的5’三磷酸發(fā)夾RNA。這個(gè)有87個(gè)核酸分子的RNA寡核苷酸含有未加帽的5`三磷酸酯末端和雙鏈片段，它們是RIG-I識(shí)別的特征結(jié)構(gòu)。3p-hpRNA是RIG-I的一種有效并特異性的激動(dòng)劑。

RIG-I/MAVS 報(bào)告基因細(xì)胞

InvivoGen欣博盛生物提供一系基于人源肺癌細(xì)胞株A549，小鼠巨噬細(xì)胞RAW和人源胚腎細(xì)胞HEK293穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，助力RNA感受器RIG-I信號(hào)通路的研究。這些細(xì)胞系包括RIG-I或MAVS基因的敲除細(xì)胞株（衍生自A549或RAW細(xì)胞系）或者RIG-I基因的過(guò)表達(dá)細(xì)胞株（衍生自HEK-293細(xì)胞系）。

描述

所有的RIG-I/MAVS報(bào)告基因細(xì)胞系均表達(dá)一個(gè)含有分泌型熒光素酶基因ISG（干擾素刺激基因）誘導(dǎo)型構(gòu)件?；罨疪IG-I/MAVS信號(hào)通路可誘導(dǎo)ISG啟動(dòng)子的活化并產(chǎn)生熒光素酶，該酶存在于細(xì)胞上清并能夠通過(guò)熒光素酶檢測(cè)試劑QUANTI-Luc™檢測(cè)定量。源于A549的細(xì)胞攜帶一個(gè)額外的NF-κB誘導(dǎo)表達(dá)分泌型堿性磷酸酶（SEAP）基因構(gòu)件，該酶的活性能夠通過(guò)SEAP檢測(cè)試劑QUANTI-Blue™檢測(cè)定量。

這些RIG-I/MAVS報(bào)告基因細(xì)胞株攜帶Zeocin™單抗性基因或Zeocin™和Blasticidin（參見(jiàn)最后一頁(yè)）雙抗性基因。

結(jié)果

使 用 RIG-I激動(dòng)劑，復(fù)合了 LyoVec™的 5’ppp-dsRNA和3p-hpRNA刺激A549-Dual™和RAW-Lucia™ ISG細(xì)胞系，ISG應(yīng)答顯著。在A549-Dual™細(xì)胞中3p-hpRNA激動(dòng)性強(qiáng)度明顯高于5’pppdsRNA，30 ng/ml的3p-hpRNA復(fù)合物活化信號(hào)已明顯高于300 ng/ml 5’ppp-dsRNA的復(fù)合物。相反，在RIG-I-KO或MAVS-KO細(xì)胞株中應(yīng)答消失。使用RIG-I配體刺激HEK-Lucia™對(duì)照細(xì)胞時(shí)ISG反應(yīng)很弱。而在HEK-Lucia™ RIG-I細(xì)胞中，由于RIG-I基因的組成型過(guò)表達(dá)導(dǎo)致這種應(yīng)答尤為強(qiáng)烈。同樣，當(dāng)使用3p-hpRNA和5’ppp-dsRNA時(shí)觀察到更高水平的ISG應(yīng)答。在衍生自A549的細(xì)胞株中NF-κB對(duì)于RIG-I配體的反應(yīng)跟ISG應(yīng)答是相似的，雖然前者更弱一些（參考網(wǎng)站數(shù)據(jù)）。

ISG對(duì)RIG-I配體的反應(yīng)：使用300 ng/ml的5’ppp-dsRNA或30 ng/ml的3p-hpRNA刺激衍生自A549的細(xì)胞；使用1 μg/ml 5’ppp-dsRNA或3p-hpRNA刺激衍生自RAW和HEK293的細(xì)胞。經(jīng)過(guò)孵育過(guò)夜，可使用QUANTI-Luc™檢測(cè)上清中Lucia熒光素酶活性的相對(duì)光單位（RLUs）以測(cè)試ISG的反應(yīng)。

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